近日，Horticulture Research在线发表了中国热带农业科学院热带生物技术研究所热带作物病毒病害与防控研究组题为An efficient papaya leaf distortion mosaic potyvirus vector for virus-induced gene silencing in papaya的论文。该论文详细阐述了如何基于番木瓜畸形花叶病毒（PLDMV）建立了可应用于番木瓜基因功能研究的病毒诱导基因沉默体系（VIGS）及其应用。

番木瓜（Carica papaya L.）是深受欢迎的兼具高营养、药用和工业价值的热带水果，在我国南方有“万寿果”、“百益果王”、“岭南佳果”等美誉。番木瓜是基因组比较小的果树（372 Mbp，2n=18），生长周期短，可全年开花结果，被认为是开展热带果树基因组研究的理想植物。首张番木瓜基因组草图早在2008年已完成，但由于番木瓜基因功能鉴定目前主要依赖周期长、工作量大、过程繁琐、转化效率低的遗传转化方法，番木瓜功能基因组的研究进展较慢。因此，迫切需要发展快速有效的番木瓜基因功能鉴定新方法。病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing，VIGS)是一种转录后基因沉默的现象，已作为一种快速，高通量的反向遗传学手段广泛应用于植物基因功能的研究，但目前尚未有用于番木瓜基因功能分析的VIGS载体。

该研究克服了马铃薯Y病毒属（Potyvirus）病毒基因组较大，在大肠杆菌宿主细胞中不稳定，不易遗传操作等问题，利用Gibson assembly策略和本研究组研发的Nimble Cloning（NC）克隆方法（Yan, et al; 2020），将前期研究获得番木瓜畸形花叶病毒(papaya leaf distortion mosaic potyvirus，PLDMV; genus: Potyvirus)弱毒株PLDMV-E改造成基于NC克隆方法的VIGS载体pPLDMV-NC。目标基因片段克隆到pPLDMV-NC载体，无需考虑酶切位点，载体也无需预先进行酶切线性化，直接可以将PCR获得的带有NC克隆通用接头的目标基因片段与pPLDMV-NC载体混合，在50 °C进行NC反应1 h即可，该策略大大简化了VIGS载体构建的遗传操作过程并提高了载体构建的成功率。通过对两个VIGS marker 基因（phytoene desaturase，PDS和Mg-chelatase H subunit, ChlH）进行VIGS验证，结果表明：携带番木瓜PDS或ChlH片段的PLDMV-NC VIGS载体接种番木瓜植株15-20天后抑制了PDS和ChlH的表达，并分别产生了明显的叶片漂白和退绿黄化等沉默表型，说明基于pPLDMV-NC的VIGS载体可有效的诱导番木瓜内源基因发生沉默。进一步，利用该载体分别对番木瓜赤霉素受体（GIBBERELLIN(GA)-INSENSITIVE DWARF1A）基因GID1A和 GID1B，番木瓜抗癌抑菌物质苄基硫代葡萄糖苷(Benzylglucosinolate, BGLS)合成途径关键基因CYP83B1进行VIGS分析，根据产生的不同沉默表型和BGLS含量变化等推断各个基因的功能。以上结果表明，构建的pPLDMV-NC VIGS载体是可应用于番木瓜基因功能研究的一个快速有效的反向遗传学工具，将有力的促进番木瓜功能基因组和分子育种的工作。另外，马铃薯Y病毒属作为目前最大的植物RNA病毒属，寄主范围非常广泛，本研究基于PLDMV的VIGS载体的构建策略将为利用其它马铃薯Y病毒属病毒成员在一些遗传转化困难的植物上建立VIGS体系进行基因功能分析提供借鉴。

中国热带农业科学院热带生物技术研究所沈文涛研究员和周鹏研究员为论文的共同通讯作者，庹德财助理研究员为第一作者。中国热带农业科学院热带生物技术研究所言普副研究员，海南大学崔红光教授和朱国鹏教授等参与了此项研究。该研究得到国家自然科学基金、中国热带农业科学院热科院热带植物病毒病害流行与防控创新团队基金和海南省自然科学基金等项目资助。

Silencing of PaPDS and PaChlH genes in papaya using the PLDMV VIGS vector

全文链接：https://www.nature.com/articles/s41438-021-00579-y